深绿木霉T_(155)产芥子酶研究

芥子酶是一种β-硫代葡萄糖苷水解酶,在一定条件下可以分解硫代葡萄糖苷产生葡萄糖、硫酸盐、异硫氰酸盐、乙腈、硫氰酸盐等物质。芥子酶分解硫代葡萄糖苷产生的异硫氰酸酯不但在植物抵抗微生物和害虫侵染中发挥着重要作用,而且能显著提高以芸薹属植物为生物熏蒸材料防控土传病害的效果。目前,芥子酶大规模、商业化生产进展缓慢,虽然直接从植物里面提取芥子酶或克隆芥子酶基因的相关报道很多,但目前仍没有实现商业化运作。而利用微生物发酵生产芥子酶可满足任何规模、任何时间的需求,产量高、质量稳定,具有巨大优势。针对此实际问题,本文以深绿木霉T155为研究对象,对其产芥子酶的酶学性质,金属离子对芥子酶活性影响、稳定酶的保护剂、芥子酶的分离纯化及蛋白鉴定开展了研究。通过设置不同的条件研究深绿木霉T155的最佳生长条件。在三角瓶中,燕麦培养基更适合深绿木霉T155生长,并且在摇床转速为180 rpm/min、接种量7块菌丝块、培养时间3d时为最佳培养条件。中试条件下,在30 L发酵罐中,深绿木霉T155最佳培养条件为输入气压0.3 MPa,罐压0.15 MPa。深绿木霉T155的最佳超声波破壁条件因菌丝量的不同会有所改变,通过设置不同超声波破壁条件,研究证明,3g深绿木霉T1ss菌丝,在功率200 w、破壁时间10 min、间隔时间20s时为最佳破壁条件。另外,设置不同温度、pH、金属离子等对芥子酶的酶学性质等开展了研究。深绿木霉T155产芥子酶的最适反应温度与pH分别为30℃、6,说明此芥子酶更适合在微酸性环境中发挥催化作用。当温度偏离30℃或过酸、过碱都会使酶活性迅速降低。芥子酶的Km值为2.364mmol/L,最大反应速率为909.1mmol(L·min)。Ag1+、Zn2+、Pb2+、 Mg2+、Hg2+对芥子酶活性主要起抑制作用,在浓度为0.069-17 g/L时,Ca2+对芥子酶的活性则主要起促进效果。为了使深绿木霉T155产生芥子酶稳定并保持较高的活性,本文研究了EDTA、DTT、甘油及其复配剂对芥子酶活性的稳定效果,结果表明加入1 mmol/L的EDTA与3 mmol/L的DTT对深绿木霉T155产芥子酶的保护作用最好,4℃保存26 d后仍能够保持85%的酶活性,有一定的实际应用潜力。最后,本实验成功以草炭作为载体制备芥子酶酶制剂,并且在4℃条件下此酶制剂能3个月之后仍能保存80%的活性。本实验通过紫外诱变获得一株芥子酶高产菌株—深绿木霉T155-UV36,其产芥子酶酶活提高了46%,并且其产纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、几丁质酶酶活均有不同程度的提高,其中p-葡萄糖苷酶酶活提高了近1倍。诱变菌株的生长条件与原始菌株类似,菌丝性状也没有发生改变。本研究通过透析、柱层析、离子交换层析等方法分别从深绿木霉T155及其诱变菌株T155-UV36中分离纯化得到了两种芥子酶,并且分子量在150 kD左右,并且,他们的洗脱图谱,电泳图谱相似,初步推测,原始与诱变菌株所产芥子酶为同一种,只是芥子酶产量有所提高。

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